1. Βασική Θεωρία
ΔΙΑΒΑΣΕ ΤΟ
Κάτι δεν κατάλαβες; Επίλεξε το κομμάτι και πάτα «Ρώτα τον Ευκλείδη». Σου το εξηγεί αμέσως.

Κλωνοποίηση mRNA — Κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης 🧪

🎯 Γιατί χρειαζόμαστε τις cDNA βιβλιοθήκες

Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς πολλά γονίδια μεταγράφονται σε ορισμένους μόνο κυτταρικούς τύπους, όπως για παράδειγμα τα γονίδια των αλυσίδων των αιμοσφαιρινών που εκφράζονται μόνο στα πρόδρομα ερυθροκύτταρα του ανθρώπου. Αν θέλουμε να κλωνοποιήσουμε μόνο τα γονίδια που εκφράζονται σε συγκεκριμένα κύτταρα, τότε κατασκευάζουμε τις cDNA βιβλιοθήκες.

Πλεονέκτημα των cDNA βιβλιοθηκών

Οι cDNA βιβλιοθήκες περιέχουν αντίγραφα των mRNA όλων των γονιδίων που εκφράζονται στα κύτταρα αυτά και έχουν το πλεονέκτημα απομόνωσης μόνο των αλληλουχιών των γονιδίων που μεταφράζονται σε αμινοξέα, δηλαδή των εξωνίων.

🔄 Στάδια κατασκευής μιας cDNA βιβλιοθήκης

Για να κατασκευαστεί μία cDNA βιβλιοθήκη ακολουθούνται τα εξής βήματα:

  1. Απομονώνεται το ολικό «ώριμο» mRNA από κύτταρα που εκφράζουν το συγκεκριμένο γονίδιο.
  2. Το mRNA χρησιμοποιείται σαν καλούπι για τη σύνθεση μιας συμπληρωματικής αλυσίδας DNA (cDNA: complementary DNA). Η σύνθεση του cDNA γίνεται από το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση. Παράγονται έτσι υβριδικά μόρια cDNA-mRNA.
  3. Το mRNA διασπάται με κατάλληλες χημικές ουσίες ή αποδιατάσσεται με θέρμανση.
  4. Τα cDNA χρησιμεύουν σαν καλούπι για τη σύνθεση μιας συμπληρωματικής αλυσίδας DNA. Το αποτέλεσμα είναι η δημιουργία δίκλωνων μορίων DNA.
  5. Τα δίκλωνα μόρια DNA εισάγονται σε πλασμίδια ή βακτηριοφάγους και κλωνοποιούνται με τη διαδικασία που αναφέρθηκε προηγουμένως (κατασκευή γονιδιωματικής βιβλιοθήκης).

Με αυτό τον τρόπο δίνουν τη δυνατότητα σύνθεσης της πρωτεΐνης ενός συγκεκριμένου γονιδίου στο κύτταρο-ξενιστή.

💉 Χρήσιμες πρωτεΐνες από ανασυνδυασμένα βακτήρια

Η κατασκευή του cDNA δίνει τη δυνατότητα σύνθεσης της πρωτεΐνης ενός συγκεκριμένου γονιδίου, που ανήκει σε ευκαρυωτικό οργανισμό, μέσα σε βακτήρια.

Οι ερευνητές Walter Gilbert και Lydia Villa-Komaroff κατόρθωσαν να συνθέσουν προϊνσουλίνη ποντικού με την παρακάτω διαδικασία:

  1. Αρχικά χρησιμοποιείται το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση για να μεταφέρει τη γενετική πληροφορία για τη σύνθεση της πρωτεΐνης, από το mRNA που έχει απομονωθεί από κύτταρα ποντικού, σε ένα μονόκλωνο cDNA.
  2. Το «καλούπι» mRNA στη συνέχεια καταστρέφεται (με την επίδραση βάσης) και, με τη βοήθεια του ενζύμου DNA πολυμεράση, συντίθεται ένας συμπληρωματικός κλώνος DNA, ο οποίος είναι συνέχεια του πρώτου.
  3. Ένα τρίτο ένζυμο, η S1 νουκλεάση, διασπά τη «φουρκέτα» που ενώνει τους δύο συμπληρωματικούς κλώνους δημιουργώντας ένα δίκλωνο μόριο.

Ένωση του δίκλωνου «ξένου» DNA με πλασμίδιο:

  • Μια τρανσφεράση επιμηκύνει τα 3′3' άκρα του προσθέτοντας μια μικρή αλληλουχία όμοιων νουκλεοτιδίων (στην περίπτωση αυτή 44 νουκλεοτίδια κυτοσίνης).
  • Ομοίως επιμηκύνονται τα κομμένα 3′3' άκρα του DNA του πλασμιδίου, με την προσθήκη μιας αλληλουχίας συμπληρωματικών νουκλεοτιδίων (44 νουκλεοτίδια γουανίνης).
  • Οι συμπληρωματικές βάσεις των μονόκλωνων άκρων σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου και τα δύο μόρια DNA ενώνονται.
  • Τέλος, ένζυμα του βακτηρίου συμπληρώνουν τα κενά ενσωματώνοντας πλήρως το «ξένο» DNA μέσα στο DNA του πλασμιδίου, το οποίο με τη σειρά του χρησιμεύει σαν φορέας εισαγωγής του DNA αυτού μέσα σε βακτήριο-ξενιστή.
Το πλασμίδιο pBR322

Το συγκεκριμένο πλασμίδιο που χρησιμοποιήθηκε από τους Walter Gilbert και Lydia Villa-Komaroff προσδιορίζεται ως pBR322 και περιέχει δύο γονίδια ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά (την πενικιλίνη και την τετρακυκλίνη). Το πλασμίδιο κόβεται με την περιοριστική ενδονουκλεάση Pst σε μια αλληλουχία αναγνώρισης που βρίσκεται στη μέση του γονιδίου που κωδικοποιεί την πενικιλινάση (ένζυμο που διασπά την πενικιλίνη).

Η ενσωμάτωση του «ξένου» DNA καταστρέφει την ενζυμική δράση της πενικιλινάσης, ενώ η ανθεκτικότητα στην τετρακυκλίνη παραμένει και χρησιμοποιείται για να επιλεγούν τα βακτήρια που έχουν δεχθεί το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο.